威尼德紫外交聯(lián)儀：UVB 誘導人皮膚成纖維細胞中 beta- catenin 基因的變化研究

威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。

胡孝輝，高豐厚，方 勇

（上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院燒傷整形科 上海 201900）

[ 摘要] 目的：觀察中波紫外線(UVB)誘導人皮膚成纖維細胞中 β-catenin 及其下游基因 c-myc 的變化，探討其在紫外線誘導光老化和腫瘤發(fā)生中的作用。方法：使用組織塊法分離培養(yǎng)原代成纖維細胞，使用第 2～8 代人皮膚成纖維細胞進行紫外線處理，倒置熒光顯微鏡觀察其形態(tài)學改變，β-gal 半乳糖苷酶細胞衰老試劑盒染色衰老細胞、western blot 檢測衰老相關蛋白 P16的表達，western blot 檢測紫外線處理人皮膚成纖維細胞各時相點 β-catenin、c-myc 蛋白表達水平，RT-PCR 檢測紫外線處理人皮膚成纖維細胞各時像點 β-catenin、c-myc mRNA 水平的表達變化。結果：40 mJ/cm2UVB 單次照射后可以誘導人皮膚成纖維細胞衰老，β-gal 衰老染色陽性率達到約 90%，衰老相關基因 P16 蛋白表達明顯升高，β-catenin、c-myc 蛋白表達水平和mRNA 水平照射后較未照射組均明顯降低。結論：紫外線 UVB 處理人皮膚成纖維細胞可以誘導其發(fā)生衰老改變，衰老細胞中β-catenin、c-myc 表達水平明顯降低，這些結果與皮膚黑色素細胞瘤相關基因改變的研究相近，為以后皮膚惡性腫瘤的研究提供了線索。

[ 關鍵詞] 人皮膚成纖維細胞；光老化；beta-catenin；c-myc

紫外線照射以后可以誘導皮膚光老化，導致皮膚變得粗糙、皺紋加深[1]，同時老化可以限制細胞的無限制生長抑制腫瘤的發(fā)生，臨床上發(fā)現(xiàn)皮膚黑色素細胞瘤多發(fā)生于非日光暴

露部位，是否紫外線在其中起了重要的作用，這其中的機制還不是十分清楚[2]。有學者認為[3]，光老化是一種癌前狀態(tài)，也有學者[4]認為細胞衰老是限制細胞發(fā)生癌變的一種保護措施。我們的研究通過紫外線照射正常人皮膚成纖維細胞誘導其光老化，并對成纖維細胞光老化過程中 beta-catenin 和c-myc 兩個癌基因的變化進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：胎牛血清和高糖 DMED 培養(yǎng)基（Gbico公司），0.25%胰酶－0.02%EDTA,β－gal 半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒（碧云天公司），2×SDS 蛋白裂解液（碧云天公

司），兔抗人 β－catenin 抗體，兔抗人 P16 抗體、兔抗人 c－myc 抗體（cell signaling），辣根過氧化物酶標記羊抗兔 Ig二抗（cell signaling）。Takara RT-PCR 擴增試劑盒（大連

生工）。VL-3000紫外交聯(lián)儀、威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。

1.2 實驗方法

1.2.1 人成纖維細胞的分離與培養(yǎng)：我院泌尿外科兒童包皮環(huán)切術后包皮（患者知情同意），去除皮下脂肪及血管根據(jù)文獻方法[5]，采用組織塊法分離獲得包皮成纖維細胞，高糖 DMEM 培養(yǎng)基加 10%胎牛血清培養(yǎng)，細胞長至 90%融合后 0.25%胰酶－

0.02%EDTA 消化傳代擴增。取第 2～8 代細胞進行實驗。1.2.2 人成纖維細胞紫外線誘導光老化：取 2～8 代人成纖維細胞使用紫外交聯(lián)儀在 312nm 中波紫外線（UVB）下照設,UVB

能量在 20～40mJ/cm2范圍內(nèi)照設后 48h 按 700 個細胞 /cm2 重新接種于六孔板中，24h 候后 β-gal 半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒檢測細胞衰老情況。1.2.3 蛋白印跡檢測衰老人成纖維細胞中 P16、β-catenin、c-myc 蛋白表達變化：取 2～8 代人成纖維細胞按 1×106個每皿接種于直徑 100mm 培養(yǎng)皿中，接種后 24h 細胞長至 80%融合，在 40 mJ/cm2UVB 紫外線下照射，于照射后第 0、12、24、48、72h 收集細胞，2×SDS 蛋白裂解液裂解細胞收集蛋白，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，一抗（β-catenin 1:1000，c-myc1:200，P16 1:1000）4℃ 結 合 過 夜 ，TBS 洗 滌 3 遍 ， 每 遍10min，加入二抗（1:2000），室溫孵育 2h，ECL 試劑盒顯色，圖像分析儀掃描成像，以 GAPDH 為內(nèi)參進行半定量分析。1.2.4 RT-PCR 檢測衰老人成纖維細胞中 β-catenin、c-mycm RNA 表達變化：取 2～8 代人成纖維細胞按 1×106個每皿接種于直徑 100mm 培養(yǎng)皿中，接種后 24h 細胞長至 80%融合，在40mJ/cm2UVB 紫外線下照射，于照射后第 0、12、24、48、72h 采用 Trizol 法提取細胞總 RNA 根據(jù) Genbank 中 β-catenin、c-myc 和 GAPDH 的 cDNA 序列設計如下引物（上海生工公司合成）。Β-catenin （120bp） 引物：5'-TGG ACT CTG GAA TCCATT CTG－3' （F）, 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'（R）, c-myc (313bp) 引物：5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATTCTG-3' （F）, 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'（R），GAPDH（289bp）引物：5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'F）, 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'（R）。以 GAPDH 為內(nèi)參，圖像分析儀掃描成像，ImageQuant 軟件半定量分析。

2 實驗結果

2.1 人皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)：采用組織塊法培養(yǎng)第 4 天開始有細胞從組織塊邊緣爬出,第 10～14 天細胞長至融合，長梭形細胞中間可見鋪路石樣細胞表皮細胞，將融合細胞按 1:3 進行傳代，傳代后細胞生長加速第 2 天可融合，從第 2 代開始細胞呈典型的長梭形，鋪路石樣表皮細胞消失。2.2 UVB 誘導成纖維細胞衰老及 β-gal 半乳糖苷酶細胞衰

老染色：UVB20～40mJ/cm2能量照射后可見細胞生長停滯呈典型衰老形態(tài)，細胞形態(tài)上變得寬大扁平，胞漿透明，胞核內(nèi)顆粒增多，(圖 1①～②)。β-gal 半乳糖苷酶細胞衰老染色

可見典型衰老細胞核周染成藍色, 對照組細胞陽性率為（18.23±3.24）%，誘導衰老組陽性率為（88.75±5.32）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖 1③。2.3 誘導衰老細胞中 P16 蛋白的表達：UVB 誘導衰老后第12h 開始衰老相關基因 P16 表達增加，隨時間延長表達量也增加，至照射后 24h 開始 P16 表達明顯高于照組前細胞（見圖 2）。2.4 UVB 誘導人皮膚成纖維細胞衰老后 β-catenin、c-myc蛋白水平變化：UVB40mJ/cm2 照射人皮膚成纖維細胞后從第12h 開始 β-catenin、c-myc 蛋白表達水平分別開始降低，至照射后第 72h 這兩種蛋白的表達水平降至zui低（見圖 3）。2.5 UVB 誘導人皮膚成纖維細胞衰老后 β-catenin、c-mycmRNA 水 平 變 化 ：UVB40mJ/cm2 照 射 人 皮 膚 成 纖 維 細 胞 后β-catenin、c-myc mRNA 表達水平分別從照射后第 48、24h開始降低，至照射后第 72h 降至zui低（見圖 4）。威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長）滿足不同的科研需求。

3 討論

β-catenin 基因位于 3p21, 全長 40 992 bp, 人類的β-catenin 基因產(chǎn)物是一個相對分子質(zhì)量為 88 000 的蛋白質(zhì)，呈高度進化保守性，大約保留了果蠅 80%的同源蛋白，與鼠的 β-catenin 幾乎*同源[6]。β-catenin 是 Wnt 通路的核心信號分子，以往研究表明[7]β-catenin 基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用。最近研究報道[8]在人皮膚黑色素細胞瘤中 β-catenin 高表達并可以抑制衰老相關基因P16 的表達，使腫瘤細胞不發(fā)生衰老保持永生化狀態(tài)，β-catenin 上調(diào)其下游基因 c-myc、cyclinD1 的表達啟動腫中國美容醫(yī)學中國美容醫(yī)學2010 年 5 月第 19 卷第 5 期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.May.2010.Vol.19.No.5基礎研究瘤的發(fā)生。而在 β-catenin 基因敲除小鼠黑色素細胞瘤中P16 表達呈劑量依賴性增加[9]。在臨床上黑色素細胞瘤多發(fā)生于紫外線所照不到的地方，且在紫外線照不到的部位β-catenin 基因高表達，這說明 β-catenin 基因的表達和

降解與紫外線照射之間存在著一定的關系。研究報道[10]Braf 誘導的衰老在哺乳動物中是限制癌前病變的生理機制, 由于紫外線照射以后 Braf 基因的突變刺激 P16 的過度表達，細胞隨后進入衰老狀態(tài)，而在日光保護部位 Braf 基因突變減少，P16 的過度表達也不能被很好的誘導[11]。在非日光暴露部位 β-catenin 基因抑制 P16 的表達,使衰老延遲,但同時也增加了其發(fā)生腫瘤的機會.而日光暴露部位因為 βcatenin 基因表達減少, 導致 P16 高表達,使

衰老提前發(fā)生。我們的研究證實通過紫外線照射以后成纖維細胞形態(tài)變的寬大扁平，胞漿透明，胞核顆粒增多，呈現(xiàn)典型的 衰老 表 現(xiàn) ， 衰 老 相 關 基 因 P16 蛋 白 表 達 也 增 高 ，而β-catenin 基因和其下游基因 c－myc 在蛋白水平和 m RNA水平表達均明顯降低，且隨著衰老時間的延長其表達水平降低越明顯，這樣就顯著降低了其發(fā)生腫瘤的可能性。

在我們的研究中對紫外線誘導人皮膚成纖維細胞衰老的機制進行的初步研究，并發(fā)現(xiàn) β-catenin、c－myc 基因在紫外線照射以后呈時間依賴性減少，為以后光療治療腫瘤提供了依據(jù)。但對紫外線照射通過何種途徑誘導 β-catenin及其下游基因 c－myc 減少則沒有進行進一步的研究；而且臨床上體表皮膚腫瘤多發(fā)生于老年人這和我們的研究結果存在矛盾，這其中的機制還需要進一步研究。