摘要

反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Luciferase基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過反轉(zhuǎn)錄病毒感染、篩選及生物發(fā)光成像分析，成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該細(xì)胞株具有穩(wěn)定的生物發(fā)光特性，適用于后續(xù)的活體成像研究。

引言

反轉(zhuǎn)錄病毒作為一種高效的基因傳遞工具，廣泛應(yīng)用于基因治療和基因功能研究。Luciferase基因作為一種常用的報(bào)告基因，其表達(dá)可以通過生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本研究通過反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的細(xì)胞株，并利用生物發(fā)光成像技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究為后續(xù)的活體成像研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為某品牌提供的HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（某試劑）DMEM培養(yǎng)基（某試劑）中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建

將Luciferase基因克隆至某品牌提供的反轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXs中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMXs-Luc。通過某品牌提供的DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 病毒包裝與感染

將pMXs-Luc質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pCL-Ampho（某試劑）共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集上清液，過濾后獲得病毒液。將病毒液感染HeLa細(xì)胞，加入8 μg/mL的Polybrene（某試劑）以提高感染效率。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選

感染48小時(shí)后，將細(xì)胞傳代至含2 μg/mL嘌呤霉素（某試劑）的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。篩選2周后，獲得穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的HeLa-Luc細(xì)胞株。

1.5 生物發(fā)光成像分析

將HeLa-Luc細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1×10^4個(gè)細(xì)胞。加入某品牌提供的Luciferase底物（某試劑），使用威尼德分子雜交儀進(jìn)行生物發(fā)光成像分析。成像條件為曝光時(shí)間1分鐘，增益設(shè)置為中等。

2. 結(jié)果與討論

2.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建與驗(yàn)證

通過測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了pMXs-Luc重組質(zhì)粒。電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒大小與預(yù)期一致，表明Luciferase基因正確插入至反轉(zhuǎn)錄病毒載體中。

2.2 病毒包裝與感染

病毒包裝后，通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)HEK293T細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)，表明病毒包裝成功。感染HeLa細(xì)胞后，通過嘌呤霉素篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的HeLa-Luc細(xì)胞株。

2.3 生物發(fā)光成像分析

生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，HeLa-Luc細(xì)胞在加入Luciferase底物后，能夠產(chǎn)生明顯的生物發(fā)光信號(hào)。隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，發(fā)光強(qiáng)度呈線性增加，表明Luciferase基因在HeLa-Luc細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

3. 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Luciferase基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并通過生物發(fā)光成像技術(shù)驗(yàn)證了其表達(dá)。該細(xì)胞株具有穩(wěn)定的生物發(fā)光特性，適用于后續(xù)的活體成像研究。本研究為基因功能研究和藥物篩選提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

1.1 將HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2 置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天傳代一次。

2. 反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建

2.1 設(shè)計(jì)并合成Luciferase基因的特異性引物，通過PCR擴(kuò)增Luciferase基因。

2.2 將PCR產(chǎn)物克隆至pMXs載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMXs-Luc。

2.3 使用某品牌提供的DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

3. 病毒包裝與感染

3.1 將pMXs-Luc質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pCL-Ampho共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。

3.2 使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為電壓250 V，電容950 μF，電阻∞。

3.3 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集上清液，通過0.45 μm濾器過濾，獲得病毒液。

3.4 將病毒液感染HeLa細(xì)胞，加入8 μg/mL的Polybrene以提高感染效率。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選

4.1 感染48小時(shí)后，將細(xì)胞傳代至含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。

4.2 篩選2周后，獲得穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的HeLa-Luc細(xì)胞株。

5. 生物發(fā)光成像分析

5.1 將HeLa-Luc細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1×10^4個(gè)細(xì)胞。

5.2 加入某品牌提供的Luciferase底物，使用威尼德分子雜交儀進(jìn)行生物發(fā)光成像分析。

5.3 成像條件為曝光時(shí)間1分鐘，增益設(shè)置為中等。

討論

本研究通過反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的HeLa-Luc細(xì)胞株。生物發(fā)光成像分析結(jié)果表明，該細(xì)胞株具有穩(wěn)定的生物發(fā)光特性，適用于后續(xù)的活體成像研究。本研究為基因功能研究和藥物篩選提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

結(jié)論

反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Luciferase基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并通過生物發(fā)光成像技術(shù)驗(yàn)證了其表達(dá)。該細(xì)胞株具有穩(wěn)定的生物發(fā)光特性，適用于后續(xù)的活體成像研究。本研究為基因功能研究和藥物篩選提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。

參考文獻(xiàn)

1. 大鼠腦膠質(zhì)瘤熒光素酶動(dòng)物模型建模細(xì)胞株C6-Luc的構(gòu)建[J].黃偉;呂明;李保衛(wèi);王玉麗;邵榮光;高鐘鎬,醫(yī)學(xué)雜志.2011,第1期

2. 熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和PET-CT成像比較[J].李小穎;高凱;董偉;張連峰,中國比較醫(yī)學(xué)雜志.2011,第3期

3. 用于活體成像的人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的構(gòu)建[J].王珂;謝四梅;何建軍;任予;夏海濱;張新偉,南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2011,第11期

4. Advances in bioluminescence imaging of live animal models[J].Flentie; Kelly;Moss; Britney;Dothager; Robin S;Pan; Mei-Hsiu,Current Opinion in Biotechnology.2009,第1期

5. Advances in imaging mouse tumour models in vivo.[J].Lyons SK,Journal of Pathology: Journal of the Pathological Society of Great Britain & Ireland.2005,第2期

6. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.[J].Christopher H; Contag;Michael H; Bachmann,Annual review of biomedical engineering.2002,第5期

7. Bioluminescence Imaging Captures the Expression and Dynamics of Endogenous p21 Promoter Activity in Living Mice and Intact Cells[J].White; Lynn S.;Piwnica-Worms; Helen;Sun; Jinwu;Tinkum; Kelsey L.;Marpegan; Luciano;Piwnica-Worms; David;Herzog; Erik D.,Molecular & Cellular Biology.2011,第18期

8. Imaging of embryonic stem cell migration in vivo.[J].Andrew S; Lee;Joseph C; Wu,Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).2011,第6期

9. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function.[J].de Almeida; Patricia E.;van Rappard; Juliaan R. M.;Wu; Joseph C.,American Journal of Physiology: Heart & Circulatory Physiology.2011,第3期