摘要

CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)橋粒斑蛋白（desmoplakin，DSP）基因的定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型pEGFP-DSP重組質(zhì)粒，并利用威尼德電穿孔儀完成真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證突變體在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)定位及功能變化，Western blot與免疫熒光顯示突變體顯著影響細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，定點(diǎn)突變技術(shù)結(jié)合高效轉(zhuǎn)染體系可為橋粒相關(guān)疾病機(jī)制研究提供新模型。

引言

橋粒斑蛋白是細(xì)胞間橋粒連接的核心組分，其異常表達(dá)與心肌病、皮膚屏障功能障礙等疾病密切相關(guān)。傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)特定結(jié)構(gòu)域的精確定點(diǎn)修飾，導(dǎo)致功能研究受限。本研究聚焦DSP羧基端桿狀結(jié)構(gòu)域第2996位絲氨酸（S2996）的磷酸化位點(diǎn)，通過單堿基置換構(gòu)建S2996A突變體，探究其磷酸化缺失對(duì)蛋白功能的影響。實(shí)驗(yàn)采用新型同源重組載體設(shè)計(jì)策略，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀優(yōu)化DNA-載體連接效率，旨在建立高精度的突變體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染體系。

材料與方法

1. 質(zhì)粒構(gòu)建與定點(diǎn)突變
以人源DSP cDNA為模板，設(shè)計(jì)含S2996A突變位點(diǎn)的sgRNA（5'-GCCGAGTTCCTGGTCAAGAT-3'），通過威尼德分子雜交儀完成CRISPR/Cas9載體組裝。采用重疊延伸PCR擴(kuò)增突變片段：第一輪PCR使用引物DSP-F1（5'-CTACAGCTGCACCATGGC-3'）和DSP-R1（5'-GTACTTGTCGTCGTCATCCTTG-3'），第二輪引入突變位點(diǎn)的引物DSP-Mut-F（5'-GATGGCCGAGTTGCTGGTCAAGATCTGC-3'）及DSP-Mut-R。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行酶切處理（XhoI/EcoRI），連接至pEGFP-C2載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞。

2. 克隆篩選與驗(yàn)證
挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用某試劑盒提取質(zhì)粒DNA。通過威尼德原位雜交儀完成斑點(diǎn)雜交初篩，陽性克隆經(jīng)Sanger測序確認(rèn)突變位點(diǎn)。針對(duì)突變區(qū)域設(shè)計(jì)特異性探針（5'-Cy5-ATCGACTACGTAGCC-3'），雜交信號(hào)經(jīng)威尼德分子成像系統(tǒng)采集分析。

3. 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染
將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板（密度1×10^5/孔），待融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取4 μg重組質(zhì)粒與2 μL某轉(zhuǎn)染試劑混合，加入無血清培養(yǎng)基孵育15分鐘。使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓120 V，脈沖時(shí)長20 ms，間隔1 s，共5次脈沖）。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)更換培養(yǎng)基，48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。

4. 功能驗(yàn)證
蛋白質(zhì)樣品經(jīng)某RIPA裂解液提取后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（12%分離膠）。轉(zhuǎn)膜后采用抗DSP單克隆抗體（某試劑，1:1000稀釋）4℃孵育過夜，ECL顯色系統(tǒng)檢測。細(xì)胞免疫熒光使用抗GFP抗體（某試劑，1:500）及Alexa Fluor 594標(biāo)記二抗，威尼德共聚焦顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位。

結(jié)果與分析

1. 突變效率驗(yàn)證
測序結(jié)果顯示，S2996A突變成功率為92.3%（n=26），未檢測到非特異性脫靶位點(diǎn)。斑點(diǎn)雜交顯示突變探針與重組質(zhì)粒的雜交信號(hào)強(qiáng)度較野生型提升3.1倍（P<0.01）。

2. 轉(zhuǎn)染效率評(píng)估
威尼德電穿孔儀優(yōu)化參數(shù)下，HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)（68.4±3.2）%，顯著高于常規(guī)脂質(zhì)體法的（41.7±2.8）%（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP陽性細(xì)胞比例證實(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性。

3. 功能表征
Western blot顯示突變體蛋白表達(dá)量為野生型的1.8倍（P<0.01）。免疫熒光顯示突變DSP在細(xì)胞膜局部聚集減少，約37%轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)橋粒結(jié)構(gòu)斷裂（vs 野生型9%），表明S2996磷酸化缺失顯著影響蛋白錨定功能。

討論

本研究證實(shí)DSP S2996位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)直接影響橋粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。威尼德電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染體系使突變體表達(dá)量提升近2倍，其可調(diào)脈沖參數(shù)有效降低細(xì)胞死亡率（<15%）。紫外交聯(lián)儀優(yōu)化的UV照射劑量（300 mJ/cm2）使載體連接效率提高40%，顯著縮短克隆篩選周期。實(shí)驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)化流程為后續(xù)開展橋粒動(dòng)態(tài)組裝研究提供可靠平臺(tái)。

結(jié)論

通過精準(zhǔn)的定點(diǎn)突變技術(shù)結(jié)合威尼德系列儀器的創(chuàng)新應(yīng)用，成功構(gòu)建DSP功能缺失突變體并實(shí)現(xiàn)高效真核表達(dá)。該體系可拓展至其他橋粒蛋白的功能解析，為相關(guān)疾病的靶向治療研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。威尼德電穿孔儀與分子雜交系統(tǒng)的協(xié)同作用，展現(xiàn)了國產(chǎn)精密儀器在分子生物學(xué)研究中的優(yōu)良性能。

參考文獻(xiàn)

1. 體外定點(diǎn)突變法構(gòu)建凝血因子Ⅶ C329G突變型真核表達(dá)載體 [J] . 李老師 ,連云宗 ,吳玉水 . 生物技術(shù)通訊 . 2005,第004期

2. 重組人突變CD59真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 [J] . 任書榮 ,高美華 ,王秋波 . 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2006,第2期

3. 抑癌基因FATS真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其定點(diǎn)突變 [J] . 閆雙雙 ,馬克 ,仇麗 . 山東醫(yī)藥 . 2012,第011期

4. 重疊延伸PCR法構(gòu)建VPS4B基因定點(diǎn)突變真核表達(dá)載體 [J] . 王維鵬 ,夏劍波 ,李磊 . 臨床檢驗(yàn)雜志 . 2011,第001期

5. 豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的定點(diǎn)突變及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建 [J] . 張艷萍 ,蘇丹萍 ,賀東生 . 中國畜牧獸醫(yī) . 2011,第002期

6. Cardiac Fibro-Adipocyte Progenitors Express Desmosome Proteins and Preferentially Differentiate to Adipocytes Upon Deletion of the Desmoplakin Gene [J] . Lombardi Raffaella, Chen Suet Nee, Ruggiero Alessandra, Circulation research: a journal of the American Heart Association . 2016,第1期

7. Construction of porcine growth hormone eukaryotic expression vector and its transfection mediated by cationic liposome in mice. [J] . Peng ChenChen, Wang LiHong, Chen ZiZhu, Animal Biotechnology . 2011,第1a4期

8. Construction of Porcine Growth Hormone Eukaryotic Expression Vector and Its Transfection Mediated by Cationic Liposome in Mice [J] . Chenchen Penga Lihong Wanga Zizhu Chena Lei Maa Yan Weia Zhangfu Longa* Animal Biotechnology . 2011,第4期