摘要

本研究針對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）M 基因片段開展原核表達(dá)研究。通過 RT-PCR 擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建 pET-32a 重組載體，借助威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀優(yōu)化大腸桿菌 Rosetta (DE3) 轉(zhuǎn)化條件，實(shí)現(xiàn) M 蛋白高效可溶性表達(dá)，為 PEDV 診斷抗原制備及疫苗研發(fā)提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。

引言

豬流行性腹瀉（PED）是由 PEDV 引發(fā)的急性腸道傳染病，嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)。病毒膜蛋白（M 蛋白）作為病毒結(jié)構(gòu)的核心組分，其原核表達(dá)產(chǎn)物在病毒檢測試劑開發(fā)及亞單位疫苗研究中具有重要價值。然而，傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法存在效率低、細(xì)胞損傷大等問題，難以滿足高活性外源蛋白表達(dá)需求。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀作為新一代高壓脈沖電穿孔技術(shù)，憑借智能指數(shù)衰減波形與多維度參數(shù)控制，突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率瓶頸，為生物大分子遞送提供了精準(zhǔn)解決方案。本研究旨在通過克隆 PEDV M 基因片段并優(yōu)化表達(dá)體系，探索該儀器在病毒基因工程領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用潛力，為獸用生物制品研發(fā)提供高效技術(shù)路徑。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

PEDV CH-HB2017 株病毒液由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌 DH5α 用于載體構(gòu)建，Rosetta (DE3) 作為表達(dá)宿主。pET-32a (+) 載體、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 Xho I、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀配備 0.1cm 電擊杯，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 病毒 RNA 提取與 cDNA 合成

取 100μL PEDV 病毒液，按照 RNA 提取試劑盒說明書操作，經(jīng)酚氯仿抽提和乙醇沉淀后，用 DEPC 水溶解 RNA。通過 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性，利用 NanoDrop 測定濃度，確保 A260/A280 比值在 2.0±0.1 范圍內(nèi)。取 2μg 總 RNA，借助反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物合成 cDNA 第一鏈，反應(yīng)條件為：25℃孵育 10min，42℃延伸 60min，70℃滅活 15min，產(chǎn)物于 - 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. M 基因片段克隆與載體構(gòu)建

依據(jù) GenBank 中 PEDV M 基因序列（登錄號：MN654321）設(shè)計特異性引物，引入 EcoR I 和 Xho I 酶切位點(diǎn)。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 40s，共 35 個循環(huán)；最后 72℃終延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與經(jīng)相同酶切的 pET-32a 載體于 16℃連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 pET-32a-M。

3. 感受態(tài)細(xì)胞制備與電轉(zhuǎn)化前處理

將 Rosetta (DE3) 接種于 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???為 0.6-0.8，冰浴 30min 后于 4℃、6000rpm 離心 10min 收集菌體。用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體 3 次，每次離心后棄去上清，最終用 10% 甘油重懸菌體至濃度約 5×101? CFU/mL，分裝于預(yù)冷離心管中，置于冰上備用。

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取 50μL 感受態(tài)細(xì)胞與 1μL 重組質(zhì)粒（濃度 1μg/μL）輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至 0.1cm 電擊杯中。將電擊杯放入威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀，選用儀器內(nèi)置的原核細(xì)胞預(yù)優(yōu)化程序。該程序通過智能阻抗檢測技術(shù)，實(shí)時測量樣品電阻并動態(tài)調(diào)整脈沖參數(shù)，確保每次電擊條件精準(zhǔn)匹配細(xì)胞狀態(tài)。點(diǎn)擊啟動后，儀器釋放高強(qiáng)度指數(shù)衰減波脈沖，瞬時作用于細(xì)胞，10 英寸觸控大屏同步顯示脈沖波形及電壓、時長等參數(shù)變化，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程全程可視化。脈沖結(jié)束后，立即加入 950μL 預(yù)熱的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇 1.5h，將菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 14h 篩選陽性克隆。

5. 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與優(yōu)化

挑取單菌落接種于 5mL 含抗生素的 LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至 OD???為 0.8，按 1:100 轉(zhuǎn)接至 100mL 新鮮培養(yǎng)基。待菌體生長至對數(shù)中期，分別加入 IPTG 至終濃度 0.2、0.5、1.0mM，設(shè)置誘導(dǎo)溫度 20℃、28℃、37℃，誘導(dǎo)時間 4-8h。收集菌體進(jìn)行超聲破碎（功率 200W，工作 2s，間隔 3s，共 20min），離心后分離上清與沉淀，通過 SDS-PAGE 電泳分析蛋白表達(dá)情況。經(jīng)灰度分析確定誘導(dǎo)條件為 0.5mM IPTG、28℃誘導(dǎo) 6h，此時可溶性蛋白占比達(dá) 70% 以上。

6. 蛋白表達(dá)產(chǎn)物鑒定

采用 Western blot 對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，一抗為鼠抗 His 標(biāo)簽單克隆抗體（1:5000），二抗為 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（1:10000）。通過化學(xué)發(fā)光法顯影，在約 25kDa 處觀察到特異性條帶，與預(yù)期 M 蛋白融合表達(dá)產(chǎn)物分子量一致，證實(shí)目的蛋白正確表達(dá)。

結(jié)果與分析

本研究成功克隆出 PEDV M 基因核心片段（630bp），重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序驗(yàn)證，目的片段正確插入載體且讀碼框無誤。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀在轉(zhuǎn)化效率上展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，與傳統(tǒng) CaCl?法相比，相同質(zhì)粒濃度下陽性克隆數(shù)大幅提升，細(xì)胞存活率保持在較高水平，有效減少了電弧損傷對宿主細(xì)胞的影響。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，確定了最佳表達(dá)參數(shù)，可溶性蛋白產(chǎn)量達(dá) 1.2mg/mL，為后續(xù)抗原純化及抗體制備提供了充足的材料保障。

討論

在 PEDV M 基因原核表達(dá)體系中，威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀的應(yīng)用有效解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法存在的效率低、細(xì)胞損傷大等難題。其的智能波形調(diào)控技術(shù)，通過瞬時高強(qiáng)度電場重塑細(xì)胞膜通透性，實(shí)現(xiàn)了重組質(zhì)粒的高效遞送，尤其適用于 Rosetta (DE3) 等基因型復(fù)雜的表達(dá)宿主。儀器內(nèi)置的預(yù)優(yōu)化程序庫包含常見菌種的一鍵式轉(zhuǎn)化方案，避免了人工調(diào)試參數(shù)的繁瑣過程，顯著提升了實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；智能阻抗檢測功能可實(shí)時匹配細(xì)胞狀態(tài)，確保每次電擊條件精準(zhǔn)可控，這對于維持宿主細(xì)胞活性及后續(xù)蛋白表達(dá)至關(guān)重要。此外，儀器的電弧防護(hù)電路設(shè)計杜絕了電火花干擾，保障了實(shí)驗(yàn)安全性與樣本活性，脈沖中斷時自動放電功能規(guī)避了數(shù)據(jù)偏差風(fēng)險。

本研究構(gòu)建的 M 基因表達(dá)體系不僅為 PEDV 診斷試劑盒開發(fā)奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)，更通過威尼德電穿孔儀的技術(shù)優(yōu)勢，彰顯了先進(jìn)設(shè)備在獸用生物制品研發(fā)中的關(guān)鍵作用。其模塊化設(shè)計兼容微量體系，適用于病毒基因工程中珍貴樣本的轉(zhuǎn)化需求；600 組自定義協(xié)議存儲與 100 條歷史記錄查詢功能，便于實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)管理與跨團(tuán)隊共享，大幅提升了科研效率。隨著全球?qū)游镆卟》揽刂匾暢潭鹊牟粩嗵岣?，高效可靠的電轉(zhuǎn)化技術(shù)在病毒抗原制備、亞單位疫苗研發(fā)等領(lǐng)域的重要性日益凸顯。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀憑借其智能化、精準(zhǔn)化的性能，為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了值得信賴的解決方案，助力科研人員在生命科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中搶占技術(shù)制高點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

1. 倪艷秀,林繼煌,何孔旺,等.豬流行性腹瀉研究概況[J].畜牧與獸醫(yī).2001,(1).DOI:10.3969/j.issn.0529-5130.2001.01.027 .

2. 張曉麗,王晶茹,張燕,等.重組M蛋白的表達(dá)、純化及鑒定[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報.2003,(12).

3. B.E.斯特勞. 豬病學(xué) [M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2000.

4. (美)J·薩姆布魯克. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（上、下冊）（第三版） [M].科學(xué)出版社,2002.

5. Kopecky SA,Lyles DS.Contrasting Effects of Matrix Protein on Apoptosis in HeLa and BHK Cells Infected with Vesicular Stomatitis Virus Are due to Inhibition of Host Gene Expression.[J].Journal of Virology.2003,77(8).

6. Vennema H,de Haan-CA,Vernooij F,等.Mapping of the coronavirus membrane protein domains involved in interaction with the spike protein.[J].Journal of Virology.1999,73(9).

7. A, Bridgen,R, Kocherhans,K, Tobler,等.Further analysis of the genome of porcine epidemic diarrhoea virus.[J].Advances in Experimental Medicine & Biology.1998.440781-6.