摘要

本研究聚焦桑樹查爾酮異構(gòu)酶（CHI）基因，通過 RT-PCR 技術(shù)從桑樹葉片中克隆獲得 Morus_CHI 基因全長 cDNA 序列。借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)，分析該基因在不同組織及脅迫處理下的表達(dá)特性，為桑樹次生代謝調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

引言

查爾酮異構(gòu)酶（CHI）是黃酮類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物抗逆響應(yīng)與藥用成分合成中具有重要作用。桑樹作為藥食同源植物，其 CHI 基因的功能解析對(duì)挖掘黃酮類活性成分合成機(jī)制、提升桑樹抗逆性具有重要意義。目前，針對(duì)桑樹 CHI 基因的克隆及表達(dá)特性研究尚缺乏系統(tǒng)報(bào)道，尤其在基因遞送效率與細(xì)胞損傷控制方面面臨技術(shù)挑戰(zhàn)。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀憑借雙波協(xié)同技術(shù)與智能防護(hù)系統(tǒng)，為原核細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染提供了創(chuàng)新解決方案，本研究將其引入桑樹基因表達(dá)分析，旨在突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)瓶頸。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

供試桑樹品種為 "湖桑 32 號(hào)"，取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所試驗(yàn)基地。大腸桿菌 DH5α、BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等均為某試劑品牌產(chǎn)品。pET-28a (+) 載體由實(shí)驗(yàn)室保存。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀及配套電極杯（2mm）用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

桑樹總 RNA 提取與 cDNA 合成

取桑樹新鮮葉片 0.1g，液氮研磨后，按照 RNA 提取試劑盒說明書操作提取總 RNA。通過紫外分光光度計(jì)檢測 RNA 濃度與純度，OD260/OD280 比值在 1.8-2.0 之間表明 RNA 質(zhì)量良好。取 1μg 總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈 cDNA，反應(yīng)體系及程序按試劑盒說明進(jìn)行。

Morus_CHI 基因克隆

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中桑樹 CHI 基因 EST 序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物：5'-ATGGCTACTCCTGCTTCT-3'，下游引物：5'-TCACTTGATGGTGGTGAT-3'。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix 25μL，上下游引物各 1μL，cDNA 模板 2μL，ddH2O 21μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段，與 pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序驗(yàn)證。

重組表達(dá)載體構(gòu)建

將測序正確的 Morus_CHI 基因片段與 pET-28a (+) 載體分別用 NcoI 和 XhoI 進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，用 T4 DNA 連接酶于 16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，采用威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。具體步驟如下：從 - 80℃冰箱取出 BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍后，取 50μL 感受態(tài)細(xì)胞與 1μL 重組質(zhì)粒輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 2mm 電極杯中，避免產(chǎn)生氣泡。在電穿孔儀操作界面，選擇大腸桿菌預(yù)設(shè)程序（系統(tǒng)內(nèi)置 200 + 種細(xì)胞株數(shù)據(jù)庫，含 E.coli 株系），儀器自動(dòng)匹配方波脈沖參數(shù)，點(diǎn)擊啟動(dòng)。電穿孔完成后，立即加入 950μL 無抗生素的 LB 培養(yǎng)基，37℃、180rpm 振蕩培養(yǎng) 1h。取 200μL 菌液涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養(yǎng)過夜。

表達(dá)特性分析

選取桑樹根、莖、葉、花、果實(shí)等不同組織，提取總 RNA 并合成 cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）分析 Morus_CHI 基因的組織表達(dá)特異性。以桑樹 β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為：上游 5'-GACTGGTGATGATATCGC-3'，下游 5'-TCGGACATCTGCTGGAA-3'；Morus_CHI 基因 qRT-PCR 引物為：上游 5'-CCTGCTTCTACGCTGCT-3'，下游 5'-GATGGTGGTGATGGTG-3'。反應(yīng)體系為 20μL：2×SYBR Green Master Mix 10μL，上下游引物各 0.5μL，cDNA 模板 1μL，ddH2O 8μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 30s；95℃變性 5s，60℃退火 30s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置 3 次重復(fù)，采用 2-ΔΔCt 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

此外，對(duì)桑樹幼苗進(jìn)行干旱（20% PEG-6000）、鹽（200mM NaCl）和紫外（UV-B，10μmol?m-2?s-1）脅迫處理，分別于處理 0、6、12、24、48h 取樣，提取葉片總 RNA 并進(jìn)行 qRT-PCR 分析，探究 Morus_CHI 基因在不同脅迫條件下的表達(dá)響應(yīng)。

結(jié)果與分析

Morus_CHI 基因克隆結(jié)果

PCR 擴(kuò)增獲得一條約 750bp 的特異性條帶，與預(yù)期的 CHI 基因開放閱讀框大小一致。測序結(jié)果顯示，該基因全長 747bp，編碼 248 個(gè)氨基酸，與 NCBI 中桑樹 CHI 基因同源性達(dá) 98%，命名為 Morus_CHI。

重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化效率

利用威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果顯示每微克質(zhì)粒 DNA 可獲得（1.2×108）個(gè)轉(zhuǎn)化子，較傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法效率提升 3 倍以上。儀器的電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測脈沖能量波動(dòng)，未出現(xiàn)電火花現(xiàn)象，有效保護(hù)了重組質(zhì)粒的完整性。

組織表達(dá)特性

qRT-PCR 結(jié)果表明，Morus_CHI 基因在桑樹不同組織中均有表達(dá)，其中葉片中的表達(dá)量最高，其次為花和果實(shí)，根和莖中的表達(dá)量相對(duì)較低。這種組織特異性表達(dá)模式可能與葉片作為光合作用和次生代謝的主要場所密切相關(guān)。

脅迫響應(yīng)分析

干旱、鹽和紫外脅迫處理后，Morus_CHI 基因的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)趨勢(shì)。在干旱脅迫下，基因表達(dá)量在 24h 達(dá)到峰值，為對(duì)照的 3.2 倍；鹽脅迫處理 12h 時(shí)表達(dá)量顯著升高，最高達(dá)對(duì)照的 2.8 倍；紫外脅迫處理 6h 后表達(dá)量開始上升，48h 時(shí)達(dá)到對(duì)照的 2.5 倍。結(jié)果表明，Morus_CHI 基因可能參與桑樹對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)過程。

討論

本研究成功克隆了桑樹查爾酮異構(gòu)酶基因 Morus_CHI，并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，其雙波協(xié)同技術(shù)可針對(duì)大腸桿菌等原核細(xì)胞的膜特性精準(zhǔn)匹配方波脈沖，結(jié)合智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)內(nèi)置的 E.coli 株系程序，無需繁瑣的參數(shù)優(yōu)化，最短 5 分鐘即可完成新細(xì)胞參數(shù)預(yù)判，大幅降低了實(shí)驗(yàn)試錯(cuò)成本。同時(shí)，電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)有效避免了電火花對(duì)樣本的損傷，確保了轉(zhuǎn)化過程中重組質(zhì)粒的完整性，為后續(xù)基因表達(dá)分析提供了可靠保障。

桑樹 CHI 基因的組織特異性表達(dá)及脅迫響應(yīng)特性，暗示其在黃酮類化合物合成及抗逆機(jī)制中具有重要作用。后續(xù)可進(jìn)一步通過基因過表達(dá)或沉默技術(shù)，深入研究該基因在桑樹次生代謝調(diào)控和抗逆性中的功能。威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀憑借其高效、低損傷的分子遞送能力，為桑樹基因工程研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，尤其在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因遞送中具有廣闊的應(yīng)用前景，可助力基因編輯、蛋白功能研究等領(lǐng)域的加速突破。

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